Резистентность клебсиелла пневмония


Что за супербактерия клебсиелла пневмонии и помогут ли от нее антибиотики? | Здоровая жизнь | Здоровье

В соцсети Twitter появились сообщения о супербактерии, которую не может «убить» ни один из предлагаемых для лечения антибиотиков. Один из белорусских пользователей продемонстрировал результаты анализа на чувствительность к клебсиелле пневмонии (Klebsiella pneumoniae): на фото бланка видно, что напротив названия каждого из 24 антибиотиков, которыми возможно лечение, стоит буква «R», обозначающая резистентность (устойчивость).

Klebsiella pneumoniae Фото: Public Domain

С аналогичной ситуацией не раз сталкивались и зарубежные медики. Так, в 2017 году американские ученые обнаружили у более чем трети обследованных пациентов клиник Хьюстона редкий штамм этой супербактерии, который оказался устойчивым к действию большинства используемых в Соединенных Штатах антибиотиков.

В том же году в прессе появилась информация о гибели в США 70-летней пациентки после заражения супербактерией Klebsiella pneumoniae: врачи не смогли спасти женщину, потому что бактерия оказалась устойчива ко всем 26 антибиотикам, которые могли использоваться для лечения. В итоге больная скончалась от сепсиса (заражения крови). А в 2012 году газета The Washington Post сообщала о том, что в госпитале Национальных институтов здравоохранения в результате вспышки инфекции, вызванной стойким к антибиотикам штаммом Klebsiella pneumoniae, умерли шесть пациентов.

Что за бактерия клебсиелла пневмонии и чем она опасна?

Речь идет об анаэробной палочковидной бактерии из рода клебсиелл, которая повсеместно встречается в окружающей среде, в том числе в почве и поверхностных водах. Клебсиеллу открыл в 1882 году микробиолог из Германии Карл Фридлендер, поэтому ее второе название — палочка Фридлендера. Эта условно-патогенная бактерия живет в организме человека, совершенно никак себя не проявляя, пока сохраняется здоровый баланс и поддерживается оптимальная микрофлора. Опасной она становится лишь тогда, когда «хорошие» бактерии ослабевают или их количество резко уменьшается.

Палочка Фридлендера может вызывать различные патологии, включая сепсис, инфекции мочевыводящих путей, бактериемию, менингит и абсцессы в печени. Довольно часто клебсиелла является причиной острой пневмонии. Инфицированию чаще всего подвержены люди с иммунодефицитами, тяжелыми сопутствующими заболеваниями и ослабленной иммунной системой.

Особенно опасной для человека является Klebsiella pneumoniae (клебсиелла пневмонии). Она является преобладающим возбудителем внутрибольничной инфекции в ряде стационаров. Источником инфекции, как правило, служит больной человек или бактерионоситель. Наиболее частые пути передачи — пищевой, воздушно-капельный и контактно-бытовой.

Где можно заразиться клебсиеллой пневмонии и смогут ли от нее вылечить?

«Klebsiella pneumoniae в настоящее время все чаще и чаще является возбудителем инфекции внутри стационара. Она в числе так называемых внутрибольничных инфекций. Бактерия приобретает сегодня множественную резистентность к большинству современных антибиотиков. Но правда состоит в том, что большинство механизмов резистентности уже осознаны, и в настоящее время создаются новые антибактериальные препараты, которые преодолевают эту резистентность. Да, конечно, клебсиелла представляет угрозу, если вовремя не понять, что инфекция вызвана ей. В таком случае все может закончиться плохо. Но если мы точно знаем, что причиной заболевания является эта бактерия, и знаем ее механизмы резистентности, то у медиков есть определенные возможности, чтобы с ней побороться. Все не совсем так безнадежно», — говорит врач, клинический фармаколог, заведующий кафедрой общей и клинической фармакологии РУДН Сергей Зырянов.

Почему клебсиелла становится все более устойчивой к антибиотикам?

Бактерии все чаще приспосабливаются к антибиотикам и передают ген устойчивости другим бактериям, таким образом появляются супербактерии. Это возбудители инфекционных болезней, которые устойчивы сразу к нескольким антибиотикам, традиционно использующимся для лечения данных заболеваний. Способность супербактерий противостоять антибиотикам вызывает озабоченность в мировом сообществе, проблему даже обсуждают на уровне Генеральной Ассамблеи ООН.

«Так, к сожалению, происходит, что все микробы, которые обитают в стационарах, становятся более устойчивыми и резистентными, поскольку в медицинских организациях при лечении часто назначают антибиотики. Микробы от этого становятся более устойчивыми к различным воздействиям, и врачам приходится применять больше сил, больше затрат, связанных с лечением такой инфекции», — говорит Зырянов. 

В отличие от других бактерий Klebsiella обладает способностью образовывать капсулу, что делает ее устойчивой во внешней среде. Такая капсула предохраняет возбудителя от высыхания, поэтому клебсиеллы могут долгое время сохраняться при комнатной температуре. Большинство штаммов Klebsiella pneumoniaе невосприимчивы к пенициллинам, цефалоспоринам III-IV поколений, аминогликозидам, фторхинолонам.

Как ранее отмечали американские врачи, особая проблема заключается в том, что некоторые штаммы клебсиеллы также стали более устойчивы к антибиотикам группы карбапенемов. Эти лекарства ранее считались наиболее эффективными при лечении инфекций, вызванных Klebsiella pneumoniae, но в последние годы стали терять эффективность.

Какие существуют способы лечения Klebsiella pneumoniae?

По словам Зырянова, нельзя говорить о том, что на клебсиеллу не действует ни один из антибиотиков. Существуют новые антибактериальные препараты, которые созданы специально для того, чтобы преодолеть резистентность клебсиеллы. Чтобы получить эффект от лечения, также применяют комбинацию уже известных препаратов.

Терапевтический эффект может иметь лечение большей дозой антибиотиков, но все зависит от конкретного штамма бактерии, конкретного антибиотика и состояния пациента. «Увеличение дозы, в зависимости от конкретного антибиотика, может оказать воздействие на бактерию. Также это зависит от того, о каком штамме клебсиеллы идет речь. Есть определенные показатели резистентности, если они позволяют это делать, то тогда таким способом пользуются. В ряде случаев увеличение дозы действительно помогает», — говорит Зырянов.

Кроме того, врач отмечает, что вне больницы заразиться этой супербактерией практически невозможно. «Клебсиелла пневмонии, которая обладает экстремальной лекарственной резистентностью, во внебольничных условиях практически не существует. Это госпитальный возбудитель», — говорит он.

клебсиелл пневмонии в медицинских учреждениях | HAI

Общая информация

Klebsiella [kleb-see-ell-uh] - это тип грамотрицательных бактерий, которые могут вызывать различные типы инфекций, связанных со здоровьем, включая пневмонию, инфекции кровотока, инфекции ран или хирургических участков и менингит. Все чаще у бактерий Klebsiella развивается устойчивость к противомикробным препаратам, совсем недавно к классу антибиотиков, известных как карбапенемы. Бактерии Klebsiella обычно встречаются в кишечнике человека (где они не вызывают заболеваний). Они также обнаруживаются в стуле человека (фекалиях). В медицинских учреждениях инфекций Klebsiella обычно возникают среди больных, получающих лечение от других заболеваний. Пациенты, для ухода за которыми требуются такие устройства, как вентиляторы (дыхательные аппараты) или внутривенные (вены) катетеры, а также пациенты, которые принимают длительные курсы определенных антибиотиков, наиболее подвержены риску заражения Klebsiella .Здоровые люди обычно не заражаются Klebsiella .

Как распространяется бактерий Klebsiella

Чтобы заразиться инфекцией Klebsiella , человек должен подвергнуться воздействию бактерий. Например, Klebsiella должна попасть в дыхательные пути, чтобы вызвать пневмонию, или в кровь, чтобы вызвать инфекцию кровотока.

В медицинских учреждениях бактерии Klebsiella могут передаваться от человека к человеку (например, от пациента к пациенту через зараженные руки медицинского персонала или других лиц) или, что реже, через загрязнение окружающей среды.Бактерии не передаются по воздуху.

Пациенты в медицинских учреждениях также могут подвергаться воздействию Klebsiella , когда они находятся на аппаратах ИВЛ (дыхательных аппаратах), у них внутривенные (вены) катетеры или раны (вызванные травмой или хирургическим вмешательством). К сожалению, эти медицинские инструменты и условия могут позволить Klebsiella проникнуть в организм и вызвать инфекцию.

Предотвращение распространения Klebsiella

Чтобы предотвратить распространение инфекции Klebsiella между пациентами, медицинский персонал должен соблюдать особые меры инфекционного контроля (см. Руководство по мерам предосторожности при изоляции: Предотвращение передачи инфекционных агентов в медицинских учреждениях, 2007 г.).Эти меры могут включать строгое соблюдение гигиены рук и ношение халатов и перчаток при входе в палаты, где содержатся пациенты с заболеваниями, связанными с Klebsiella . Медицинские учреждения также должны соблюдать строгие процедуры очистки, чтобы предотвратить распространение Klebsiella .

Для предотвращения распространения инфекций пациенты также должны очень часто мыть руки, в том числе:

  • Перед приготовлением или употреблением пищи
  • Прежде, чем дотронуться до глаз, носа или рта
  • До и после смены повязок или повязок на рану
  • После посещения туалета
  • После сморкания, кашля или чихания
  • После прикосновения к больничным поверхностям, таким как перила кровати, прикроватные тумбочки, дверные ручки, пульты дистанционного управления или телефон

Лекарственная устойчивость Клебсиелла

Некоторые бактерии Klebsiella приобрели высокую устойчивость к антибиотикам.Когда бактерии, такие как Klebsiella pneumoniae , производят фермент, известный как карбапенемаза (называемый организмами, продуцирующими KPC), тогда класс антибиотиков, называемых карбапенемами, не будет работать для уничтожения бактерий и лечения инфекции. Виды Klebsiella являются примерами Enterobacteriaceae, нормальной части кишечных бактерий человека, которые могут стать устойчивыми к карбапенемам.
CRE, что означает устойчивые к карбапенемам Enterobacteriaceae, представляет собой семейство микробов, которые трудно лечить, поскольку они обладают высокой устойчивостью к антибиотикам.К сожалению, карбапенемные антибиотики часто являются последней линией защиты от грамотрицательных инфекций, устойчивых к другим антибиотикам.

Лечение Klebsiella инфекций

Klebsiella Инфекции, не устойчивые к лекарствам, можно лечить антибиотиками. Инфекции, вызванные бактериями, продуцирующими KPC, трудно поддаются лечению, поскольку против них действует меньшее количество антибиотиков. В таких случаях микробиологическая лаборатория должна провести тесты, чтобы определить, какие антибиотики будут лечить инфекцию.

Что делать пациентам, если они думают, что у них заболевание, связанное с клебсиеллой ?

Обратитесь к поставщику медицинских услуг.

Что делать пациентам, если у них диагностировано заболевание, связанное с клебсиеллой ?

Они должны соблюдать режим лечения, предписанный врачом. Если поставщик медицинских услуг прописывает антибиотик, пациенты должны принимать его точно в соответствии с инструкциями врача. Пациенты должны пройти назначенный курс лечения, даже если симптомы исчезли.Если лечение прекращается слишком рано, некоторые бактерии могут выжить, и пациент может снова заразиться. Пациенты должны мыть руки как можно чаще и соблюдать все остальные гигиенические рекомендации.

Как можно узнать, является ли инфекция Klebsiella лекарственной устойчивостью?

Медицинский работник назначит лабораторные анализы, чтобы определить, является ли инфекция Klebsiella лекарственной устойчивостью.

Может ли инфекция Klebsiella распространиться на членов семьи пациента?

Если члены семьи здоровы, они имеют очень низкий риск заражения инфекцией Klebsiella .По-прежнему необходимо соблюдать все меры предосторожности, особенно гигиену рук. Бактерии Klebsiella распространяются в основном при контакте между людьми, и гигиена рук - лучший способ предотвратить распространение микробов.

Рекомендации и руководящие указания

Для получения дополнительной информации о профилактике и лечении HAI см. Ресурсы ниже:

,

Что такое клебсиелла пневмония? Симптомы, причины, диагностика, лечение и профилактика

Клебсиелла - это «супербактерия», вызывающая ряд заболеваний в зависимости от того, какую часть тела она поражает.

Klebsiella pneumoniae - это бактерия, которая обычно обитает в кишечнике человека и не вызывает заболеваний.

Однако, если K. pneumoniae попадает в другие части тела, это может вызвать ряд различных заболеваний.

К ним относятся:

Как распространяется Klebsiella Pneumoniae

K.pneumoniae обычно являются «внутрибольничными» инфекциями, что означает, что они заразились в больнице или медицинском учреждении.

Люди с ослабленной иммунной системой, а также больные или раненые, проходящие процедуры по поводу различных заболеваний, с большей вероятностью могут заразиться клебсиеллой.

По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), здоровым людям обычно не нужно беспокоиться о заражении K. pneumoniae.

Бактерии не переносятся по воздуху, поэтому вы не можете заразиться K.pneumoniae при вдыхании того же воздуха, что и инфицированный человек.

Вместо этого K. pneumoniae передается при прямом контакте между людьми, например, когда кто-то зараженными руками касается раны.

Инфекции также могут возникать при использовании зараженного медицинского оборудования.

Например, люди на аппаратах ИВЛ могут заразиться клебсиеллой пневмонией, если дыхательные трубки заражены бактериями.

Аналогичным образом использование зараженных внутривенных катетеров может привести к инфекциям кровотока.

Прием антибиотиков в течение длительного времени также может увеличить риск заражения клебсиеллой.

Признаки и симптомы Klebsiella Pneumoniae

Симптомы инфекции K. pneumoniae различаются в зависимости от того, где находится инфекция, и аналогичны симптомам тех же заболеваний, вызываемых другими микробами.

Например, менингит, вызванный K. pneumoniae, вызывает характерные симптомы бактериального менингита, включая лихорадку, спутанность сознания, ригидность шеи и чувствительность к яркому свету.

Инфекции кровотока (бактериемия и сепсис), вызванные клебсиеллой, вызывают лихорадку, озноб, сыпь, головокружение и изменение психического состояния.

Пневмония, вызванная K. pneumoniae, может вызывать:

  • Лихорадку и озноб
  • Гриппоподобные симптомы
  • Кашель, при котором может выделяться слизь желтого, зеленого или кровянистого цвета
  • Проблемы с дыханием

Лечение и лекарства для лечения Klebsiella Pneumoniae

Врачи обычно используют антибиотики для лечения K.pneumoniae.

Однако появление устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий усложнило ситуацию.

Некоторые штаммы «супербактерии» K. pneumoniae устойчивы к большинству антибиотиков, включая карбапенемы, которые считаются лекарствами последней инстанции.

Эти бактерии вырабатывают ферменты, называемые карбапенемазами Klebsiella pneumoniae (KPC), которые делают антибиотики неэффективными.

Эти выносливые микробы с высоким уровнем угрозы являются частью группы, называемой устойчивыми к карбапенемам Enterobacteriaceae, или CRE.

Устойчивые к карбапенемам клебсиеллы являются наиболее распространенным типом CRE, по данным CDC, ежегодно вызывая около 7 900 инфекций и 520 смертей.

Для лечения CRE врачи полагаются на несколько мощных антибиотиков, которые все еще обладают некоторой эффективностью против бактерий, особенно при использовании в комбинации, согласно отчету за январь 2013 года в журнале «Диагностическая микробиология и инфекционные заболевания ».

Эти препараты включают:

.

Оценка эффективности бактериофага при лечении пневмонии, вызванной множественной лекарственной устойчивостью. Klebsiella pneumoniae у мышей

Множественная лекарственная устойчивость Klebsiella pneumoniae (MRKP) постоянно выходит за рамки контроля над антибиотиками. Однако бактериофаг считается потенциальной альтернативой антибиотику для лечения бактериальных инфекций. В этом исследовании литический бактериофаг, фаг 1513, был выделен с использованием клинического изолята MRKP KP 1513 в качестве хозяина и охарактеризован.На нем образовывалась прозрачная бляшка с ореолом, и она была классифицирована как Siphoviridae. Он имел короткий латентный период 30 мин, размер пакета 264 и мог ингибировать рост KP 1513 in vitro в зависимости от дозы. Интраназальное введение разовой дозы 2 × 10 9 БОЕ / мышь через 2 часа после инокуляции KP 1513 могло защитить мышей от летальной пневмонии. В модели сублетальной пневмонии мыши, обработанные фагом, демонстрировали более низкий уровень нагрузки в легких K. pneumoniae по сравнению с необработанным контролем.Эти мыши потеряли меньшую массу тела и показали более низкий уровень воспалительных цитокинов в легких. Очевидно, что фаговая терапия улучшила состояние поражения легких. Таким образом, фаг 1513 обладает большим эффектом in vitro и in vivo , который может быть использован в качестве альтернативы лечению антибиотиками пневмонии, вызванной мультирезистентным K. pneumoniae .

1. Введение

Klebsiella pneumoniae ( K.pneumoniae ) - одна из наиболее распространенных грамотрицательных бактерий, вызывающих внутрибольничные бактериальные инфекции, включая пневмонию, бактериемию, инфекции мочевыводящих путей, абсцесс печени и раневые инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом [1, 2]. Пневмония, вызываемая K. pneumoniae , обычно связана с высоким уровнем смертности. Фактически, несмотря на разработку антибиотиков широкого спектра действия, уровень смертности среди инфицированных Klebsiella pneumonia был выше 50% [3].Кроме того, лечение Klebsiella pneumoniae стало более трудным из-за роста во всем мире штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, оставляя лишь ограниченные возможности клинического лечения [4–8]. Фактически, около 80% нозокомиальных инфекций, вызываемых K. pneumoniae , вызваны этими штаммами с множественной лекарственной устойчивостью; частота изолятов БЛРС (бета-лактамазы расширенного спектра действия) колеблется от 8% до 44% [9, 10].

Бактериофаги или фаги - это вирусы, которые специфически атакуют и убивают свои бактерии-хозяева; этот процесс рассматривается как возможный метод лечения для борьбы с бактериальными инфекционными заболеваниями.Лечение бактериофагом особенно желательно из-за побочных эффектов и неэффективности, связанных с антибиотиками, а также из-за появления новых устойчивых к антибиотикам штаммов. Бактериофаги привлекают все большее внимание как альтернатива борьбе с бактериальными инфекционными заболеваниями с помощью антибиотиков, поскольку отказ от лечения антибиотиками позволит избежать распространения мультирезистентных бактерий [11–14]. По сравнению с антибиотиками фаги обладают многими преимуществами, такими как высокая численность, специфичность к хозяину, быстрая экспоненциальная репликация и снижение численности при уменьшении количества бактерий-мишеней.Более того, фаговая терапия уже была протестирована на различных видах бактерий и достигла некоторых достижений [15–17]. Например, Chhibber et al. доставлял фаг внутрибрюшинным путем для лечения экспериментальной крупозной пневмонии, которая была вызвана у мышей K. pneumoniae и имела высокую эффективность [9]. Однако внутрибрюшинное введение фага не было бы ни практичным, ни эффективным для лечения пневмонии у людей. В настоящем исследовании мы оценили терапевтическую эффективность фага 1513, который вводили интраназально для защиты от пневмонии, индуцированной штаммом K с множественной лекарственной устойчивостью.пневмония .

2. Материалы и методы
2.1. Бактериальный штамм

Штамм K. pneumoniae был выделен от пациента с пневмонией в больнице Чжуншань при Даляньском университете (Далянь, Китай) и затем обозначен как KP 1513. KP 1513 был идентифицирован как устойчивый к множественным антибиотикам и ESBL. -продуцирование штамма с помощью системы Walk Away Plus (Siemen's Diagnostics). Запасы штамма хранили при -80 ° C в бульоне Луриа-Бертани (дрожжевой экстракт 5 г, триптон 10 г и 10 г NaCl в 1 л дистиллированной воды), содержащем 25% глицерина.

2.2. Выделение, обогащение и очистка бактериофага

KP 1513 использовали в качестве хозяина для выделения литического фага из образцов сточных вод больницы Чжуншань, входящей в Даляньский университет. Вкратце, 20 мл пробы сточных вод центрифугировали при 5000 g в течение 5 минут при 4 ° C для удаления мусора и почвы. Затем супернатант объединяли и добавляли CaCl 2 до 1 ммоль л -1 . Десять мл этого супернатанта объединяли с 10 мл бульона 2 × LB и 2 мл раствора бактерий, а затем инкубировали в течение 12 ч при 37 ° C при встряхивании (120 об / мин).Затем питательные бульоны центрифугировали при 8000 g при 4 ° C в течение 5 мин. Супернатант объединяли и пропускали через фильтр 0,22 мкм мкм (Millipore, США). Метод двухслойного агара использовался для подтверждения присутствия фага в фильтрате и рассчитывалась единица образования бляшек (БОЕ). Одиночные бляшки трижды субкультивировали для очистки от фага. Суспензию, содержащую специфический фаг, инкубировали с ДНКазой I и РНКазой (1 мкг мкг / мл -1 , Такара, Япония) при 37 ° C в течение 30 мин перед добавлением NaCl (1 моль л -1 ) и полиэтиленгликоль 8000 (PEG8000; Sigma) для осаждения фаговых частиц.Этот фаг был обозначен как фаг 1513, и его ресуспендировали в буфере SM (NaCl 5,8 г, MgSO 4 · 7H 2 O 2 г, Tris · Cl 1 моль л -1 и 2% желатина 5 мл в 1 л. дистиллированной воды, pH 7,5). Затем проводили равновесное ультрацентрифугирование хлорида цезия (150000 g в течение 24 ч в роторе Beckman Ti50) для дальнейшей очистки от фагов. Полосу, содержащую фаг, собирали и диализовали против буфера TBS (NaCl 8 г, KCl 0,2 г и трис-основание 3 г в 1 л дистиллированной воды, pH 7.4 с чистой HCl) при 4 ° C в течение ночи. Затем фаги пропускали через гель для удаления эндотоксинов Detoxi-Gel (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) для удаления эндотоксинов из фагового препарата. Наконец, очищенные фаги хранили при 4 ° C до использования.

2.3. Характеристика фага 1513

Просвечивающая электронная микроскопия использовалась для наблюдения фага 1513 с помощью электронного микроскопа JEM-1200EX (JEOL, Япония) после отрицательного окрашивания фосфорновольфрамовой кислотой.

Были проведены испытания на термическую стабильность, pH и стабильность хлороформа.Аликвоты суспензий фагов с высокими титрами (2 × 10 8 БОЕ мл -1 ) инкубировали при 4 ° C, 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C, 60 ° C и 70 ° C (pH 7) в течение 60 мин или при 4 ° C (pH 3–12) в течение 10 ч или в смеси с хлороформом и инкубируют при 4 ° C в течение 24 ч. Титры фагов проверяли методом двухслойного агара.

Эксперимент по одностадийному росту был проведен путем модификации метода, описанного Эллисом и Дельбруком [18]. Вкратце, фаг добавляли в бульонную культуру KP 1513 до MOI (множественность инфекции) 0.1. Затем образец инкубировали при 37 ° C в течение 15 минут, чтобы способствовать адсорбции фага-хозяина. Смесь центрифугировали при 12000 g при 4 ° C в течение 10 минут для удаления любых свободных фаговых частиц. Супернатант удаляли, и осадок ресуспендировали в бульоне LB. Вышеупомянутую процедуру центрифугирования повторяли еще раз. Осадок ресуспендировали в 100 мл среды LB и инкубировали при 37 ° C при встряхивании. Аликвоты отбирали с 10-минутными интервалами, и титр фага определяли методом пятен.

Секвенирование генома было выполнено Shenzhen Genomics Institute (Шэньчжэнь, Китай) с использованием платформы высокопроизводительного секвенирования Illumina (Illumina HiSeq 2000) на ДНК, полученной с помощью стандартных процедур SDS-протеиназы K. Полная последовательность генома фага 1513 была доступна в GenBank (номер доступа KP658157).

2.4. Бактерицидный эффект фага 1513 In vitro

Аликвоту ночной культуры KP 1513 высевали в свежую среду LB и инкубировали в течение 6 ч при 37 ° C при встряхивании (150 об / мин).Бактерии осаждали и ресуспендировали в PBS до OD 650 0,6 (~ 2 × 10 9 КОЕ / мл -1 ). Различные концентрации фага 1513 (2 × 10 10 , 2 × 10 9 и 2 × 10 8 БОЕ мл -1 ) или PBS (контроль) добавляли к посевному материалу и затем инкубировали в течение 12 часов. при 37 ° С при встряхивании (150 об / мин). За ростом бактерий следили путем измерения OD 600 с интервалом 30 минут.

2,5. Мыши

Семинедельные самки мышей Swiss-Webster (вес ~ 25 г на мышь) были приобретены в Даляньском медицинском университете в Даляне, Китай (SCXK 2008-0002).Все процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по этике Даляньского медицинского университета.

2.6. Смертельная пневмония у мышей Модель

Группы из 10 мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией кетамина (120 мг / кг -1 ) и ксилазина (12 мг / кг -1 ) и инокулировали 20 мкл л инокулята KP 1513. (2 × 10 8 КОЕ / мышь) интраназально. LD 50 КП 1513 составляла 4,17 × 10 9 КОЕ / мл -1 интраназально в предыдущем исследовании.В экспериментах по фаготерапии однократная доза фага (2 × 10 9 , 2 × 10 8 и 2 × 10 7 БОЕ / мышь) или PBS вводилась интраназально через 2 часа после заражения.

2.7. Бактериальная нагрузка, гистопатология и анализ цитокинов легочной ткани

Группы из 11 мышей были инокулированы интраназально 6 × 10 7 КОЕ / мышь фагов KP 1513 (6 × 10 7 БОЕ / мышь) или интраназально вводили PBS. 2 ч после заражения. Через 24 часа после заражения пять мышей из каждой группы были умерщвлены, левые легкие были удалены и зафиксированы 10% формалином в течение не менее 24 часов при 4 ° C, а затем были отправлены в отделение патологии больницы Чжуншань для получения гематоксилина. -эозин (HE) краситель.Еще 6 мышей из каждой группы подвергали эвтаназии и взвешивали, а их легкие полностью гомогенизировали в стерильном физиологическом растворе. Аликвоту гомогената замораживали при -80 ° C для тестирования цитокинов (TNF- α и IL-6) с использованием набора Mouse ELISA Kit (Nanjing Jiancheng, Китай). Оставшийся гомогенат разбавляли и высевали на агар Лурия-Бертани для определения единицы образования колонии. Для определения уровня фага, присутствующего в легких, гомогенат центрифугировали при 4000 g для получения супернатантов.Супернатанты фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, мкм, перед проведением метода двухслойного агара для расчета количества фагов с помощью бляшкообразующей единицы (БОЕ).

2,8. Статистический анализ

A log ra

.

Смотрите также